应用骨髓移植治疗白血病等恶性血液疾病已有50 多年的历史。但骨髓中造血干细胞（HSC）数量较低，移植后难以在患者体内有效进行造血重建，这也成为HSC 临床应用的一个瓶颈。
之前研究者曾采用加入多种细胞因子的液体培养基、与基质细胞共同培养或在生物反应器中培养等方法体外扩增造血干/祖细胞（HSPC），但上述方法仍不能获得充足的具有植活能力的HSPC用于临床治疗。
HSC在体内的行为有多种选择，如自我更新、分化、迁移（归巢）、静息、凋亡等，在这些不同的选择背后，有一个非常复杂的信号通路调节系统。
目前体外培养HSPC主要依靠在培养基中加入血清及SCF、TPO、Flt3L 等细胞因子，但扩增效果仍不理想，HSPC很快便发生分化、衰竭。小分子化合物指相对分子质量小于10 000 的化合物。某些小分子化合物在体外培养中显示了其独特的优势。
首先，化合物的作用效果可通过调节化合物的结构、浓度来改变，其过程简单可控；其次，小分子化合物相较于细胞因子或转录因子等其性质更为稳定，化合物的前期处理以及给药非常方便。
因此，在传统扩增HSC的方法中加入某些小分子化合物，甚至完全采用小分子化合物替代现有的血清、细胞因子等物质，可能对体外扩增HSPC更为适宜。
目前已有许多小分子化合物可针对HSC 的自我更新、分化、迁移（归巢）、凋亡等选择发挥作用，进而促进HSPC的体外扩增，我们仅对部分小分子化合物及其作用机制进行综述。
一、促进HSC自我更新相关的小分子化合物
自我更新是HSC最为重要的特征之一。自我更新能力的丧失是目前体外培养HSC的主要障碍。已知有多种信号通路与HSC自我更新相关，例如Notch、Wnt和Shh等。
1. 嘌呤衍生物StemRegenin（SR1）：
Boitano 等对100 000 种杂环化合物进行无偏倚筛选后，获得一种SR1，该化合物被认为可在体外促进HSPC扩增。在体外培养人脐带血来源CD34+细胞时加入SR1 及细胞因子SCF、TPO、Flt3L、IL-6 共培养5 周后，与相应对照组相比，CD34+细胞增加了47 倍，相同条件下培养人外周血来源CD34+细胞3 周即可使CD34+细胞增加73 倍。
而一旦去除了SR1 后，细胞则迅速发生分化。通过集落形成实验表明，加入SR1 培养后可显著提高各系细胞集落形成单位（CFU）形成。
另外，值得注意的是，SR1仅对人、猴、狗来源的HSPC发挥作用，而对小鼠来源HSPC无扩增作用，提示SR1 的作用机制可能存在种属特异性。
将用这种方法扩增的CD34+细胞植入免疫缺陷的NOD.Cg- PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠体内，发现NOD-SCID重建细胞（SRC）增加了17倍，并且均可保持多系细胞长期重建能力。这也是现有小分子化合物中体外扩增HSPC效果最为显著的小分子化合物。
通过机制研究发现，SR1 可抑制细胞色素P450 1B1（CYP1B1）和香烃受体抑制物（AHRR）的表达，两者在转录水平均受到芳香烃受体（AhR）的调节，证明SR1可能作为一种拮抗剂作用于AhR信号通路。
而AhR在HSC中不仅可作为一种配体激活的转录因子来诱导药物代谢酶活性，还与造血作用调节中的多个信号通路相关，例如HES-1、CMYC、C/EBP、PU.1、β-catenin、CXCR4、STAT5 等，但其具体分子机制仍在研究中。
2. 糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）抑制剂CHIR99021：
前期研究表明CHIR99021 可用于支持胚胎干细胞自我更新以及小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）重编程。Perry 等使用CHIR99021 抑制GSK3β的作用，激活Wnt/β-catenin 信号通路，并采用高胰岛素的培养基来激活PI3K/AKT 信号通路，同时加入细胞因子SCF、TPO，培养14 d 即可以观察到小鼠Lin-Sca-1+c-kit+（LSK）细胞数量增加，随后的体内移植实验证明该细胞具有HSPC功能。
Huang 等将CHIR99021 与mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）联合应用，并采用无血清无细胞因子培养体系研究这两种小分子化合物的组合对HSPC 的扩增作用。
通过人脐带血来源CD34+细胞体外培养实验发现，即使在无血清无细胞因子存在下，CHIR99021+ Rapamycin（简称C+R）处理仍可扩增人HSPC。在该无血清无细胞因子培养条件下，3 d 后细胞总数可扩增至7 倍。
随后将培养后的细胞植入NSG小鼠体内，一次移植时C+R处理的细胞植活能力与细胞因子（SCF、TPO、IGF-2、FGF-1）处理组水平相当，但其二次移植的植活能力则显著高于添加细胞因子培养组或对照组。
GSK3β 可抑制mTOR 信号通路的作用，当采用CHIR99021 抑制GSK3β时，可相应激活mTOR信号通路，进而影响HSPC归巢。Huang 等采用C+R处理可使处于S、G2/M 期细胞数量略有增加，表明其可能对细胞周期进程产生影响，但并未显著影响细胞死亡；同时，通过条件敲除小鼠实验证明，由Ctnn1b 编码的β-catenin 对于C+R 的扩增作用有重要影响。
但其具体机制仍有待进一步研究。上述化合物的组合实验以及其他前期实验表明，Wnt/β-catenin 信号通路及PI3K/AKT/mTOR信号通路对于维持HSC 自我更新能力具有非常关键的作用，因此在后续实验中可通过优化作用于这两条关键信号通路化合物的结构及组合以达到更好的体外扩增效果。
3. 6- bromoindirubin 3′- oxime（BIO）：
BIO 也是一种GSK-3β抑制剂，Ko 等在体外培养中加入BIO 及SCF、TPO、Flt3L，发现BIO 可减缓细胞周期的进程并可抑制细胞的分化，但SRC数量并没有增加，结合上述研究提示BIO 对CD34+细胞自我更新的影响可能是由于mTOR信号通路的激活而受到抑制。
随后的移植实验表明，体外培养时加入BIO 促进小鼠体内人源CD45+细胞的增殖，并可提高人源CD34+细胞的植活水平，但对静止期CD34+细胞并无影响，说明BIO的作用确实与细胞周期相关，其作用可能仅针对处于增殖期的细胞。
BIO的作用机制主要有以下两方面：一是BIO处理后下调的细胞周期蛋白Cyclin D1以及上调的细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂（CKI）家族成员p57 可能在细胞周期延迟中发挥作用，从而促进长周期SRC 的扩增。另一种观点认为，BIO 可作用于Wnt/β-catenin 信号通路，而这些通路与HSPC的体外扩增均密切相关，其具体机制有待进一步研究。
4. NR-101：
近期许多研究显示骨髓增生性白血病病毒原癌基因c-MPL（TPO受体）在维持HSC稳定中发挥了重要作用。Nishino 等通过筛选发现c-MPL 小分子激动剂NR-101。在短期培养中，NR-101 可引起SRC提高2.9 倍，而同样条件下TPO 则无明显作用。
在体外培养时，HSC 会迅速进入细胞周期并发生分化，生成终末细胞。而NR-101引发细胞周期进程是较为缓慢的，这可避免HSPC的过度分化，从而维持了其自我更新能力。
5. 5-氮脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine，5azaD）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂（trichostatin A ，TSA）：
5azaD 和TSA是两种染色质修饰试剂。体外实验表明，5azaD/TSA 联合细胞因子SCF、Flt3L、巨噬细胞生长因子（MGDF）、IL-3 培养人脐血来源CD34+细胞7 d 后，SRC数量可提高10 倍，其机制可能是通过减缓细胞周期进程，因而促进HSC的自我更新。
6. 山竹子素（GAR）：
GAR（garcinol）是一种由印度藤黄分离出的苯甲酮衍生物。它主要通过抑制组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性发挥作用。同时，GAR的衍生物Iso-GAR也被发现具有更高的HAT抑制作用。
体外培养人脐血来源CD34+细胞时用GAR及SCF、TPO刺激培养7 d 后CD34+CD38－细胞数量增加4.5 倍以上，而Iso-GAR活性更高，同样培养条件下可将CD34+CD38－细胞数量提高7.4 倍。
将GAR及细胞因子SCF、TPO处理过的细胞移植入NOD/SCID小鼠体内，8 周后进行的SRC频率分析显示，SRC数量上升了2.2倍。
7. 四乙烯五胺TEPA：
铜在细胞内主要以两种形式存在：一是与化合物稳定地结合，另一种则是与其他物质疏松地结合，较为不稳定。Peled 等发现，HSPC内铜的含量可调节其自我更新以及多向分化潜能，因此他们合成了一种稳定的TEPA铜螯合剂用以螯合细胞内的铜离子，进而降低细胞内铜的水平，促进HSC自我更新。
短期（3 周）培养CD34+细胞时加入TEPA 及细胞因子TPO、IL-6、Flt3-L、IL-3 可扩增祖细胞亚群（CD34+CD38－细胞以及CD34+CD38－Lin－细胞），同时可增加CFU形成数量，并提高SRC在NOD/SCID小鼠中的植活能力。而采用CuCl2则会降低CD34+及其早期亚群细胞数量。
二、抑制HSC分化相关小分子化合物
成人体内HSC 通常处于静息状态，但当机体受到损伤或疾病状态下，HSC可进入细胞周期并发生多系分化，生成一系列终末成熟细胞。但HSC 一旦进行分化后，其自我更新能力随即丧失，因此在体外培养HSC时应抑制其分化。
1. 丙戊酸（VPA）：
VPA是一种安全并且广泛应用的临床药物，主要用于治疗神经系统疾病。已有研究显示VPA可调节肿瘤细胞的生长、分化、凋亡等。体外培养人脐血来源CD34+细胞时加入VPA可使细胞数量扩增25 倍，3 周后CD34+细胞数量相较于对照组仍明显增加，并且VPA可提高其他细胞因子对于CD34+细胞的扩增作用，这些结果表明VPA可选择性地作用于CD34+细胞。
2. 二乙基氨基苯甲醛（DEAB）：
乙醛脱氢酶（ALDH）在HSC 中也高表达，被认为是人HSC 的一个选择性标志。早期已有研究显示，ALDH可保护骨髓中造血祖细胞免受细胞毒性药物环磷酰胺杀伤作用。
Chute 等研究显示，ALDH 在HSC 的分化调节中起关键作用，使用ALDH 抑制剂DEAB 可延迟细胞因子扩增人HSC 时所诱导的细胞分化。在同样培养条件下扩增人脐血来源CD34+CD38－细胞14 d 后，细胞数量仍可保持稳定。
CFU 结果表明，加入DEAB及细胞因子SCF、TPO、Flt3L 培养7 d 后，CFU数量下降至10%，表明DEAB可抑制HSC的成熟以及分化，保留了更多的未成熟细胞。
移植实验表明，将SCF+TPO+Flt3L+DEAB 处理的CD34+CD38－细胞植入NOD/SCID 小鼠8 周后，即可在小鼠外周血检测到来源于人的CD45+细胞。随后进行的二次移植发现DEAB可维持人HSC在小鼠体内的植活水平。研究显示，DEAB主要通过影响维甲酸受体信号通路以及HOXB4信号通路发挥作用。
三、促进HSC归巢相关小分子化合物
髓外组织中的HSC 可迁移进入骨髓，此过程即成为归巢。有报道表明通过小分子化合物提高HSC 的归巢能力，也可提高HSC 的植活水平，例如尼克酰胺（Nicotinamide，NAM）。NAM是维生素B3的一种形式，对多种细胞均具有不同的作用，如调节细胞的黏附、极性、迁移、增殖、分化等。
研究表明，NAM可通过调节去乙酰化酶（sirtuin，SIRT1）作用于CD34+细胞。NAM可作为SIRT1 的抑制剂，在与其他细胞因子共同使用情况下，可延迟CD34+细胞分化，并促进其迁移、归巢以及提高移植成活率。
SIRT1 是一种烟酰胺腺嘌呤二核式酸（NAD）依赖的去乙酰化酶，可通过NAD的裂解来催化一系列重要转录因子的去乙酰化，产生的NAM可抑制SIRT1 作用。曾有研究显示，SIRT1-/-小鼠其造血祖细胞体外扩增能力增强，但并未进行自我更新能力和体内功能检测。
Peled 等发现在体外培养时加入NAM可使CD34+细胞增加80 倍，总细胞量增加400 倍，同时分化细胞数量明显降低。
四、抑制HSC凋亡相关小分子化合物
HSC通常通过不对称分裂来维持其自身数量的恒定，但当HSC发生过度增殖，有形成肿瘤的危险时，其会通过凋亡来确保HSC 数量及功能的稳定。在体外培养中，由于HSC处于促进其扩增的培养环境中，可能引发其凋亡进程。因此，抑制HSC凋亡也可一定程度上对HSC的体外扩增发挥重要作用。
1. 前列腺素E2（PGE2）：
PGE2 是一种体内含量十分丰富的类花生酸，可调节人体多种生理功能。近期研究发现，PGE2 在造血调节过程中具有重要作用。已有文献证明PGE2在体内以及体外均参与造血调节。
Hoggatt 等研究表明，体外培养HSPC时加入PGE2可以提高细胞的归巢、存活、增殖，并可增加长期重建细胞（LTRC）以及竞争性重建单位（CRU）频率，并且增加的HSPC 竞争优势是稳定的，在连续移植时仍能保持一定水平，且仍具有全部的多系重建能力。
2. Caspase 抑制剂及钙蛋白酶抑制剂：
HSC干性功能的维持需要各种调节细胞自我更新、分化以及凋亡相关的信号通路协调作用。有研究显示，细胞凋亡与细胞的不对称分裂之间存在着十分密切的联系。
Sangeetha 等在实验中采用了两种化合物：Caspase 抑制剂zVADfmk和钙蛋白酶抑制剂zLLYfmk 来促进HSC 体外扩增。体外实验表明，培养人脐血来源CD34+细胞时，加入zVADfmk或zLLYfmk 及SCF、TPO、Flt3L、IL-6 后，培养10 d 后CD34+CD38－细胞数量扩增3 倍，同时并不引起细胞分化。
体内动物实验证实，在同样培养条件下加入zVADfmk 或zLLYfmk 处理的细胞植入NOD/SCID小鼠体内后，16 周后这些细胞的成活水平明显上升，并已在小鼠体内进行多系分化。
3. 血清素：
血清素（5-HT）是一种单胺类神经递质，可激活5-羟色胺受体（5-HTR），促进巨核细胞生成过程中的有丝分裂，其在中枢神经系统、胃肠道、心血管系统中均发挥重要作用。
近期研究发现，血清素可在体外扩增人脐血来源CD34+细胞，同时还可发挥抗凋亡作用，因此可被认为是体外扩增HSC的一种新方法。
Yang 等发现，在无血清培养条件下，体外培养人脐血CD34+细胞时加入血清素以及SCF、TPO、Flt3L，培养8 d 后CD34+细胞数量增加了12.2 倍。
随后将相同条件下培养的细胞植入NOD/SCID 小鼠体内，6 周后取骨髓、脾、外周血进行流式细胞术分析，结果发现来源于人的CD45+细胞比例升高，同时可检测到各系细胞。
HSC 在体外失去了体内环境，因而易于发生分化或衰竭，这是体外培养HSC 首先需要解决的问题。小分子化合物则有希望帮助我们解决HSC的体外扩增问题。
从上述研究中可看出，目前已有许多类型的小分子化合物可在体外提高CD34+细胞及其亚群的比例，同时还可提高处理细胞的移植成活能力，证明了小分子化合物的促进扩增作用。
另外，小分子化合物的作用通路主要集中于一些重要的信号通路，例如Wnt、PI3K/AKT、Notch 等，这也从侧面证明了在HSC的自我更新过程中这些信号通路发挥了至关重要的作用，也为干细胞方向性选择调节的研究提供了部分依据。
不可否认的是，尽管这些小分子化合物被认为有效，但目前尚未有任何小分子化合物已被批准上市。对于小分子化合物的研究多处于实验室阶段，距离其真正应用于临床仍十分遥远。这其中首要原因就是小分子化合物的安全性问题。其扩增能力是否可控、是否产生致瘤性等都是目前研究上没有解决的问题。
同时，对于这些小分子化合物的作用机制研究仍不十分透彻，对其潜在的不良反应尚无清楚的认识，因而还需要大量的实验来验证其安全性及有效性。
另一方面，目前仍缺乏联合使用方面的研究，组合用药可增强化合物的扩增效果，同时也可避免化合物的毒性作用，因此多条通路的联合应用可能会成为下一步的研究热点。综上所述，通过不断的研究，以期最终获得一系列对体外扩增人HSPC 行之有效的化合物，并真正应用于临床，从而为血液系统疾病的治疗带来重大突破。
来源：中华血液学杂志