幽门螺杆菌对胃腺癌AGS细胞动力学的影响及其机制探讨

发布时间:[2011.11.29] 点击:802次

    正常胃黏膜的结构和功能依赖于胃上皮细胞动力学的稳定。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)是胃黏膜组织最重要的致病菌，被认为与胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤等密切相关，并被世界卫生组织列为Ⅰ类致癌原，但其致病机制仍未明确。因此，研究HP对人胃上皮细胞生长动力学的影响具有重要意义，能够为明确HP的致病机制提供更多的证据。
    本实验观察Hp作用下人胃腺癌上皮细胞株AGS细胞的生长情况、细胞活力及细胞周期改变，并检测热休克蛋白(HSP) 70、p21和增殖细胞核抗原( PCNA)的蛋白表达，以了解Hp在体外对AGS细胞动力学的影响，并探讨其可能的分子机制。
    一 材料与方法
    1 主要实验材料：Hp菌株[美国模式培养物集存库( ATCC)编号700392，VacA+ /CagA+]由浙江大学医学院附属邵逸夫医院戴宁教授惠赠。人胃癌上皮细胞株AGS细胞(ATCC编号CRL-1739)由温州医学院附属第一医院消化疾病研究所细胞室保存。HSP70抗体购自美国Sigma公司，β-actin抗体和p21抗体购自美国Santa Cruz公司。PCNA鼠一抗购自上海康成生物工程有限公司，二抗购自北京中杉公司。
    2 Hp的培养：将Hp接种到含5%羊血的选择性培养基上，置37℃、95%湿度微需氧环境中(5% O2、10%C02、85 %N2)培养。48 h后收集细菌，用含10%胎牛血清无抗生素的RPMI 1640培养液制成新鲜细菌悬液。
    3 AGS细胞的培养：在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中，37℃、5%CO2条件下培养。
    4 Hp与AGS细胞共培养：将对数生长期的AGS细胞以5 *103／孔接种于96孔板，置37℃、5%CO2的培养箱中培养。细胞贴壁后，换为新鲜细菌悬液，置微需氧环境中共培养。采用浓度及时间梯度实验，细菌／细胞分别为100:1、200:1、500:1，观察时间芽0、4、8、24、48 h；以未加Hp的AGS细胞为对照组，每组设3个复孔。倒置显微镜下观察各组细胞的生长情况。
    5 细胞活力的检测：采用四甲基偶氮唑盐( MTT)比色法，在酶联免疫检测仪波长490 nm处测量吸光度(A)值。在一定细胞数目范围内，A值与活细胞数量呈正比，可间接反映细胞的增殖情况。
    6 细胞周期的检测：细胞经血清饥饿同步化24 h后，换以新鲜Hp细菌悬液（细菌／细胞为200：1）共培养，对照组不加Hp，分别在0、6、12、24 h收集细胞，以70%乙醇固定，经RNA酶处理和碘化丙啶(PI)标记后上流式细胞仪检测细胞周期，重复3次。
    7 Western印迹试验检测HSP70、p21及PCNA的蛋白表达：细菌／细胞为200:1，对照组不加Hp，共培养6、12、24和48 h后收集细胞，提取细胞总蛋白并测定蛋白质浓度。蛋白电泳分离后转膜，封闭。加入一抗Hsp70(1:4000) ,p21(1: 200) ,PCNA(1: 400)和β-actin ( 1 : 1000)4℃过夜，缓冲液漂洗3次后加二抗室温孵育1h。采用化学发光法感光、显影、定影。
8 统计学处理：采用软件SPSS 15. 0进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，并进行t检验。P<0. 05为差异有统计学意义。
    二 结果
    1 倒置显微镜下观察AGS细胞的生长情况：24 h后，与Hp共培养的各组细胞生长稀疏，出现明显的脱壁现象，贴壁细胞周边及培养液中可见较多细菌及细胞崩解后的残留颗粒；且Hp浓度越高，培养时间越长，上述表现越明显。对照组细胞生长良好，未见细菌附着于细胞周边，脱壁细胞较少。见图1。

 
    2 Hp对AGS细胞活力的影响：在4h及8h后，共培养组的细胞活力均较对照组增加，其中(500：1)组共培养4h后的A值为0.24±0.01，( 200:1)组共培养8h后的A值为0.28±0.02，( 100：1)组共培养8h后的A值为o．32±o．05，与对照组（4 h:0.20±0.01，8 h:0.23±0.02）比较差异有统计学意义(t =5.2372，t =3.2733，t=2.8922,P值均<0.05)。而共培养24 h后，共培养各组的细胞活力均较对照组下降，其中( 200：1)组A值（0.29±o．03）和(500:1)组A值(0.25±0.02)，与对照组(0. 35±0.026)比较，差异有统计学意义（t=3.6186，t=5.3452,P值均<0.05）。共培养48 h后，共培养各组的细胞活力较对照组下降更为显著（P值均<0. 05），且细菌浓度越高，细胞活力下降越明显（见图2）。

 
    3 Hp对AGS细胞周期的影响：不同时间点Hp共培养组(细菌／细胞为200:1)与对照组AGS细胞周期的结果如图3，4所示。与对照组相比，Hp作用6、12、及24 h后处于G2/M期的AGS细胞比例明显增加，提示Hp使AGS细胞发生G2/M期阻滞。
 

 
    讨论 由于正常胃上皮细胞在体外培养难度较大，稳定性差，目前国内外普遍以胃腺癌细胞系作为研究Hp与胃上皮细胞相互关系的体外模型。本实验参考文献将Hp与AGS胃上皮细胞系在体外共培养，结果显示一个有趣的现象，在共培养早期(4 h和8 h)，Hp能增强胃上皮细胞活力，提示Hp感染早期能短暂促进细胞增殖，可能是细胞对抑制物的早期应激反应。而24 h后各种浓度的Hp均明显抑制AGS细胞的生长和增殖，且细菌浓度越高、作用时间越长，表现越明显，提示Hp感染后期对AGS细胞生长和增殖主要表现为明显的抑制作用，可破坏胃上皮细胞增殖和凋亡的平衡，可能是Hp慢性感染导致慢性萎缩性胃炎的机制之一。Hp对胃上皮细胞的作用从感染早期促增殖至后期抑制生长和增殖的转化可能与其毒力因子或相关蛋白的合成一分泌一作用需要一定的时间有关，但其具体机制有待进一步的研究。其他的体外研究，，部分显示Hp增加胃上皮细胞的增殖率，而相对多数的体外实验则显示相反的结果，另外也有一些研究显示低浓度Hp促进胃上皮细胞增殖，而高浓度则抑制细胞增殖，促进凋亡。这些实验结果的不同可能与实验设计、方法和材料等的不同有关，如有些实验选择活的Hp，有些选择Hp培养物上清液或其裂解物，选择的菌株和细胞系也不尽一致。
    细胞周期通常可分为Gl期、S期、G2期和M期，与细胞的生长、增殖及凋亡密切相关。保持细胞周期的稳定对维持正常的胃上皮动力学具有重要的作用。对细胞周期进行调控的关卡主要有Gl/S限制点和G2/M限制点。本实验显示Hp可引起G2/M期AGS细胞的比例明显增加，提示Hp可使AGS细胞周期阻滞于G2/M期，与Peek等的结果相似，可能是其抑制胃上皮细胞生长和增殖的机制之一。也有一些研究显示Hp可引起胃上皮细胞G1期阻滞或S期阻滞，可能与菌株有关。
    HSP70是热休克蛋白家族中含量最丰富的一种，是一种重要的分子伴侣，具有促进细胞增殖、抗细胞凋亡的作用，并可通过调节细胞周期所必须的蛋白构象而影响细胞周期，Rohde等的研究显示HSP70减少可引起细胞G2/M期阻滞。本实验显示Hp感染后AGS细胞内HSP70的表达明显降低，与Pierzchalski等的研究结果相似，提示Hp可能通过下调胃上皮细胞HSP70的表达而使细胞发生G2/M期阻滞，生长和增殖的抑制。但三者的的关系及其具体的分子机制尚待进一步的研究。
    P21蛋白是目前已知的具有最广泛激酶抑制活性的细胞周期抑制蛋白，为CKIs的INK4家族成员，广泛地作用于CDK-cyclin复合物并抑制它们的活性而引起细胞周期的阻滞，抑制细胞增殖。P21不仅可引起细胞Gl/S期阻滞，也可引起细胞G2/M期阻滞。PCNA是DNA多聚酶δ的辅助因子，DNA合成过程中的必需物质，与DNA复制及细胞增殖有关。PCNA与核酸代谢中的多种调节蛋白密切相关，如P53、P21、CyclinD、Gadd45等。本实验显示Hp感染后AGS细胞p21表达增加，与Xia等的研究结果相似，而PCNA无明显变化，提示Hp可能通过改变p21,21的表达进而导致细胞周期阻滞、抑制细胞生长。也有研究显示HSP70抑制可引起p21的表达增加8.8倍，本实验同时观察到了Hsp70表达的下降和p21的表达的增加，但两者之间的关系尚待进一步的研究。
    总之，本实验提示Hp可明显影响胃上皮细胞AGS的的动力学，早期短暂促增殖，后期则可引起细胞周期的阻滞而明显抑制细胞生长和增殖。Hp可下调HSP70，并改变p21的表达，可能是其阻滞胃上皮细胞周期、抑制细胞生长和增殖的机制，但三者之间的关系及其具体的分子机制尚待进一步研究明确。来源：华语消化网